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本发明涉及一种离子液体调控生物酶及其降解环境激素西维因的方法和降解率测定方法，离子液体调控生物酶包括在pH值为2～5的磷酸缓冲液中加入氯过氧化物酶、季铵盐类离子液体和H2O2形成的混合溶液，在混合溶液中，氯过氧化物酶的浓度为0.005～0.05μmol·L-1，季铵盐类离子液体的浓度为0.06～0.20mol·L-1，H2O2的浓度为0.05～0.5mmol·L-1。本发明采用氯过氧化物酶为生物催化剂，季胺盐类离子液体为调控因子，季胺盐类离子液体具有对氯过氧化物酶的共溶剂作用，增加氯过氧化物酶的稳定性，增大了酶催化速率，提高氯过氧化物酶的有效利用率，应用于西维因的降解时，能够有效改善西维因的溶解性，提高降解率。
3.一种离子液体调控生物酶降解环境激素西维因的方法，其特征在于：在 pH值为2～5的磷酸缓冲液中加入西维因、氯过氧化物酶、季铵盐类离子液体和 H2O2，直至氯过氧化物酶的浓度为0.005～0.05μmol·L-1，季铵盐类离子液体的浓 度为0.06～0.20mol·L-1，H2O2的浓度为0.05～0.5mmol·L-1，混合均匀形成反应体 系，在反应体系中，西维因与H2O2的摩尔比为1:(3～30)，避光反应5～20分 钟，完成环境激素西维因的降解。
20世纪50年代，以西维因(CBL)为代表的氨基甲酸酯类农药进入市场， 成为继有机磷农药的第二主力军。西维因(Carbaryl)，又称胺甲萘或甲萘威， 有良好的残效和内吸性，对害虫具有触杀和胃毒作用，是一种广谱的杀虫剂， 被广泛用于果树、蔬菜、粮食、药材、茶等农作物。但是，随着使用的日益广 泛，其毒性作用也日益暴露，特别是近年来被发现对人体内分泌系统有干扰作 用，属环境激素类物质(EDS)，能够损害生殖系统，影响人类健康(一般是性 腺功能的失调、生殖能力的降低等)。并且西维因在农业领域的广泛应用威胁土 壤生态系统的环境安全。因此，发现一种环境友好型的高效催化环境激素西维 因的新方法对于预防因西维因过量而给人类的健康带来的危害是至关重要的。
目前，常用的处理环境激素的方法主要有膜分离技术法、物理吸附法和化 学氧化法等。其中膜分离技术法的去除率比较好，但是处理过程不仅与处理的 目标物的性质有关，而且还与膜的性质以及溶液的组成等有关，而且膜组件的 价格比较昂贵，又时常存在堵塞及溶胀的状况，因此很难将膜分离技术在废水 处理中广泛应用。物理吸附法在处理过程中成本比较高、处理的不彻底并且不 确定性多。使用化学氧化法降解西维因虽然能比较高效、无选择性并且比较完 全的降解有机物，但是在处理过程中不可避免的引入新的杂质，对环境造成负 担；并且化学法成本较高，将其用于工业废水的全程处理上还存在着一些困难。
氯过氧化物酶是Hager等从海洋真菌中提取出来的一种具有氯化活性的过 氧化物酶(Chloroperoxidase，EC1.11.1.10，简称CPO)，它是一种应用极其广 泛的过氧化物酶，具有较高的催化效率。因其独特的活性位点结构而具有卤化、 环氧化、磺化氧化、过氧化以及羟基化等多种多样的催化活性。CPO不仅对底 物具有广泛的适应性，且近年来越来越引人关注的是其可以对有机农药及环境 激素类物质进行高效催化降解，可用来作为一种环境友好型的生物降解的新方 法。
本发明降解西维因的方法的技术方案是：在pH值为2～5的磷酸缓冲液中加 入西维因、氯过氧化物酶、季铵盐类离子液体和H2O2，直至氯过氧化物酶的浓 度为0.005～0.05μmol·L-1，季铵盐类离子液体的浓度为0.06～0.20mol·L-1，H2O2的浓度为0.05～0.5mmol·L-1，混合均匀形成反应体系，在反应体系中，西维因 与H2O2的摩尔比为1:(3～30)，避光反应5～20分钟，完成环境激素西维因的 降解。
本发明采用氯过氧化物酶为生物催化剂，季胺盐类离子液体为调控因子， 双氧水作氧化剂，而且是处于pH值为2～5的磷酸缓冲液中，由实验可知，其中 氯过氧化物酶会在特定pH值2.5～3.0下有较高的催化降解活性，同时季胺盐类 离子液体具有对氯过氧化物酶的共溶剂作用，增加氯过氧化物酶的稳定性，增 大了反应过程中的酶催化速率，提高氯过氧化物酶的有效利用率，本发明是一 种环境友好型降解激素的新体系，应用前景可观，应用于微溶性环境激素西维 因的降解时，能够有效改善反应体系中底物西维因的溶解性，提高降解率。
本发明在含有季胺盐类离子液体、CPO和双氧水等的混合溶液中对西维因 进行酶催化生物降解，可有效改善反应体系中微溶性底物西维因的溶解性，增 加了CPO的稳定性，增大了反应过程中的酶催化速率，提高了CPO的有效利用 率。并且该方法操作简单方便，酶的用量非常少、催化效率高，显著降低酶催 化降解的成本，降解速率非常快，在20分钟内降解率就能达到90％以上。另外， 在本发明的催化降解过程中可避免化学方法降解西维因中由于其它化学物质的 引入而产生的二次污染，是工业上处理废水的一个非常有效的前处理手段，是 一种环境友好型的生物降解方法。
(2)按西维因与H2O2的物质的量比为1:(3～30)，将初始浓度为100μmol·L-1的西维因溶液、初始浓度为3～30μmol·L-1的氯过氧化物酶溶液、初始浓度为 10mol·L-1的季铵盐类离子液体溶液和初始浓度为10mmol·L-1的H2O2溶液分别加 入到磷酸缓冲液中，并通过调整磷酸缓冲液的加入量，直至混合均匀，形成反 应体系，在反应体系中，氯过氧化物酶的浓度为0.005～0.05μmol·L-1，季铵盐类 离子液体的浓度为0.06～0.20mol·L-1，H2O2的浓度为0.05～0.5mmol·L-1，各原料 用量按最终反应体系的体积计算取用；本发明中通过将氯过氧化物酶、季铵盐 类离子液体和H2O2等先配制成溶液，再进行混合，利于混合均匀，可防止因加 入H2O2的浓度过大而使氯过氧化物酶失活，并且，氯过氧化物酶会在特定pH 值下有较高的催化降解活性，所以先配置好各溶液在按比例加入可增加反应效 率，提高降解率；同时各溶液加入到磷酸缓冲液中，相对磷酸缓冲液的体积来 说，加入的各溶液体积较小，对磷酸缓冲液的pH值无明显影响；
(4)降解反应完成后，用微量移液枪移取与反应体系等体积的乙酸乙酯到 离心管中进行萃取，每一个降解反应完成后的反应体系都萃取3次，每次萃取 的时间间隔约为10分钟，将每次萃取后的上层有机相液体移入100mL的蒸馏瓶 中混合后进行旋转蒸发，将蒸馏瓶中的溶剂蒸干后再向蒸馏瓶中加入一定体积 的乙腈或甲醇溶解，得到样品。再用0.22μm的有机相过滤膜对样品进行过滤， 之后就可用高效液相色谱对制得的样品进行分析测定。并用以下公式进行降解 率的计算：
以下将总体积为3mL的反应体系为实施例进行详细说明，并且在配制这 3mL的反应体系溶液中，初始浓度为100μmol·L-1的西维因溶液加入量始终为 500μL，CPO溶液的加入量始终为5μL，形成一定体积比例，由此可见相对磷酸 缓冲液的体积来说，加入的各溶液体积较小，对磷酸缓冲液的pH值影响可直接 忽略，所以最终反应体系溶液的pH值等于磷酸缓冲液的pH值；将反应体系溶 液加入到体积为10mL的离心管中，离心管要用锡箔纸包住，保证反应是在避光 下进行的。
(2)按西维因与H2O2的物质的量比为1：(9～12)，取500μL初始浓度为 100μmol·L-1的西维因溶液，5μL初始浓度为4.8μmol·L-1的氯过氧化物酶溶液， 36μL初始浓度为10mol·L-1的四甲基溴化铵溶液，和45～60μL初始浓度为 10mmol·L-1的H2O2溶液分别加入到磷酸缓冲液中，并通过磷酸缓冲液定容至 3mL，混合均匀，形成反应体系，在反应体系中，各物质浓度如下：氯过氧化物 酶的浓度为0.008μmol·L-1，四甲基溴化铵的浓度为0.12mol·L-1，H2O2的浓度为 0.15～0.2mmol·L-1。
(2)按西维因与H2O2的物质的量比为1：6，取500μL初始浓度为 100μmol·L-1的西维因溶液，5μL初始浓度为30μmol·L-1的氯过氧化物酶溶液， 60μL初始浓度为10mol·L-1的四甲基溴化铵溶液，和30μL初始浓度为10mmol·L-1的H2O2溶液分别加入到磷酸缓冲液中，并通过磷酸缓冲液定容至3mL，混合均 匀，形成反应体系，在反应体系中，各物质浓度如下：氯过氧化物酶的浓度为 0.05μmol·L-1，四甲基溴化铵的浓度为0.20mol·L-1，H2O2的浓度为0.2mmol·L-1。
(2)按西维因与H2O2的物质的量比为1：3，取500μL初始浓度为 100μmol·L-1的西维因溶液，5μL初始浓度为6μmol·L-1的氯过氧化物酶溶液，18μL 初始浓度为10mol·L-1的四乙基溴化铵溶液，和15μL初始浓度为10mmol·L-1的 H2O2溶液分别加入到磷酸缓冲液中，并通过磷酸缓冲液定容至3mL，混合均匀， 形成反应体系，在反应体系中，各物质浓度如下：氯过氧化物酶的浓度为 0.01μmol·L-1，四乙基溴化铵的浓度为0.06mol·L-1，H2O2的浓度为0.05mmol·L-1。
(2)按西维因与H2O2的物质的量比为1：30，取500μL初始浓度为 100μmol·L-1的西维因溶液，5μL初始浓度为12μmol·L-1的氯过氧化物酶溶液， 45μL初始浓度为10mol·L-1的四丁基溴化铵溶液，和150μL初始浓度为 10mmol·L-1的H2O2溶液分别加入到磷酸缓冲液中，并通过磷酸缓冲液定容至 3mL，混合均匀，形成反应体系，在反应体系中，各物质浓度如下：氯过氧化物 酶的浓度为0.02μmol·L-1，四丁基溴化铵的浓度为0.15mol·L-1，H2O2的浓度为 0.5mmol·L-1。
(2)按西维因与H2O2的物质的量比为1：24，取500μL初始浓度为 100μmol·L-1的西维因溶液，5μL初始浓度为18μmol·L-1的氯过氧化物酶溶液， 27μL初始浓度为10mol·L-1的四丁基溴化铵溶液，和120μL初始浓度为 10mmol·L-1的H2O2溶液分别加入到磷酸缓冲液中，并通过磷酸缓冲液定容至 3mL，混合均匀，形成反应体系，在反应体系中，各物质浓度如下：氯过氧化物 酶的浓度为0.03μmol·L-1，四丁基溴化铵的浓度为0.09mol·L-1，H2O2的浓度为 0.4mmol·L-1。
(2)按西维因与H2O2的物质的量比为1：18，取500μL初始浓度为 100μmol·L-1的西维因溶液，5μL初始浓度为24μmol·L-1的氯过氧化物酶溶液， 54μL初始浓度为10mol·L-1的四丙基溴化铵溶液，和90μL初始浓度为10mmol·L-1的H2O2溶液分别加入到磷酸缓冲液中，并通过磷酸缓冲液定容至3mL，混合均 匀，形成反应体系，在反应体系中，各物质浓度如下：氯过氧化物酶的浓度为 0.04μmol·L-1，四丙基溴化铵的浓度为0.18mol·L-1，H2O2的浓度为0.3mmol·L-1。
(2)按西维因与H2O2的物质的量比为1：15，取500μL初始浓度为 100μmol·L-1的西维因溶液，5μL初始浓度为27μmol·L-1的氯过氧化物酶溶液， 30μL初始浓度为10mol·L-1的四甲基溴化铵溶液，和75μL初始浓度为10mmol·L-1的H2O2溶液分别加入到磷酸缓冲液中，并通过磷酸缓冲液定容至3mL，混合均 匀，形成反应体系，在反应体系中，各物质浓度如下：氯过氧化物酶的浓度为 0.045μmol·L-1，四甲基溴化铵的浓度为0.1mol·L-1，H2O2的浓度为0.25mmol·L-1。